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皮革水解蛋白是皮革廢料或動物皮毛、臟器等水解生成的一種蛋白粉，對于乳與乳制品中皮革水解蛋白的鑒定，主要是通過對L-羥脯氨酸含量的測定。L-羥脯氨酸是膠原蛋白(皮革水解蛋白)特有的氨基酸，在乳酷蛋白中則沒有，所以一旦檢出，則可認(rèn)為可能含有皮革水解蛋白，即可判斷該乳制品中有可能含有由廢棄皮革而來的成分。

賽智科技應(yīng)用質(zhì)檢部采用L-羥脯氨酸衍生方法，利用公司自己的LC-10Tvp高效液相色譜儀，對L-羥脯氨酸進行了分析檢測試驗，并通過公司的VI2010色譜工作站進行了詳細分析，得出的檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可靠。

（方案僅供參考）

以下是L-羥脯氨酸的測定的詳細檢測方法：

1 儀器與試劑

1.1 LC-10Tvp高效液相色譜儀 

1.2 Vertex 色譜柱　250mm×4.6mm×5μm

1.3 11 mL水解瓶

1.4 1.5 mL塑料離心管

1.5 20 mL玻璃具塞刻度試管

1.6 5 mL玻璃具塞刻度試管

1.7 0.22 μm針頭式過濾器

1.8 2 mL樣品瓶

2 試劑

2.1 甲醇（色譜純）

2.2 乙腈（色譜純）

2.3 正己烷（色譜純）

2.3 三乙胺（色譜純）

2.4 冰醋酸（色譜純）

2.5 磷酸氫二鈉（無水色譜純）

2.6 磷酸二氫鈉（無水色譜純）

2.7 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品

2.8 蛋白水解試劑：稱取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL濃鹽酸(36%-38%，摩爾濃度約為12 mol/L)，然后加水定容至100 mL。

2.9 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，然后用純水定容至1000 mL。

2.10 衍生劑PITC溶液：將250 μL異硫氰酸苯酯(PITC)用乙腈定容至10 mL。

2.11 三乙胺溶液：將1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。

2.12 衍生劑DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶于50 mL乙腈。

2.13 Na2B4O7緩沖溶液：稱取1.91 g Na2B4O7?10H2O，用50 mL純水溶解。

2.14 氨基酸儲備液：稱取一定量L-羥脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到濃度為 0.05 mol/L的儲備溶液。

2.15 氨基酸使用液：將儲備液用0.1 mol/L HCl水溶液稀釋，得到濃度為0.0003 mol/L的L-羥脯氨酸溶液。

2.16 磷酸鹽緩沖溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。

實驗方法

1 樣品水解

(1) 稱取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中(1.1.3)，加入蛋白水解試劑(1.2.8)，旋緊蓋子，振蕩混勻，110 °C下反應(yīng)24 h。

(2) 反應(yīng)完畢，將反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至100 mL蒸餾瓶中，75℃下減壓蒸餾至近干。

(3) 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液(1.2.9)分三次溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移到20 mL玻璃具塞刻度試管(1.1.5)，再用純水定容至20 mL，待衍生。

2 樣品衍生

2.1 異硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法

(1)樣品水解溶液衍生

量取200 μL樣品水解溶液，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液(1.2.11)和100 μL衍生劑PITC溶液(1.2.10)，混勻，室溫反應(yīng)1h，加入400μL正己烷(1.2.3)，旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過濾器(1.1.7)過濾，待分析。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化

量取200 μL L-羥脯氨酸使用液*(1.2.15)，置于1.5 mL塑料離心管中，加入100 μL三乙胺溶液(1.2.11)和100 μL衍生劑PITC溶液(1.2.10)，混勻，室溫反應(yīng)1h，加入正己烷400 μL(1.2.3)，旋緊蓋子后劇烈振蕩5~10 s，靜置分層，取200 μL下層溶液與800 μL水混合，經(jīng)0.22 μm針式過濾器(1.1.7)過濾，待分析。

根據(jù)實際情況，氨基酸使用液濃度可進行調(diào)整，本方法中氨基酸使用液濃度僅供參考。

2.2 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生方法

(1) 樣品溶液衍生

取0.5 mL樣品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度試管(1.1.6)中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液(1.2.13)和0.5 mL衍生劑DNFB溶液(1.2.12)，具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液(1.2.16)定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器(1.1.7)過濾，待分析。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生

取0.5 mL L-羥脯氨酸使用液(1.2.15)置于5 mL玻璃具塞刻度試管(1.1.6)中，加入0.5 mL Na2B4O7緩沖溶液(1.2.13)和0.5 mL衍生劑DNFB溶液(1.2.12)，具塞搖勻，于60 °C下避光反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢將試管置于冷水中冷卻，用磷酸鹽緩沖溶液(1.2.16)定容至5 mL，混勻后經(jīng)0.22 μm針式過濾器(1.1.7)過濾，待分析。

3 色譜條件

3.1 異硫氰酸苯酯(PITC)衍生色譜條件

色譜柱：   Vertex 色譜柱250mm×4.6mm×5μm

流動相A：  0.05mol/L乙酸鈉水溶液（冰乙酸調(diào)節(jié)PH值為6.50±0.05）

流動相B:   甲醇：乙腈：水=20:60:20（V:V:V）

流速：     1.0 mL/min

檢測波長： UV 254 nm

柱溫：     45℃

進樣體積： 10μL

3.2 梯度程序：

4二硝基氟苯(DNFB)衍生色譜條件

色譜柱：   Vertex 色譜柱

流動相A：  0.02mol/L Na2HPO4+ 0.02mol/L NaH2PO4水溶液

流動相B:   甲醇：乙腈=10:90（V:V）

流速：     1.0 mL/min

檢測波長： UV 360 nm

柱溫：     35℃

進樣體積： 10μL

梯度程序：

3 色譜圖